RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術。RACE是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段,通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。RACE是由Frohman等(1988年)發明的一項技術。?使用此方法的要求是必須知道至少23-28個核苷酸序列信息,以此來設計5’末端和3‘末端RACE反應的基因特異性引物(GSPs)。?如果沒有對比樣品和對照的產量,利用Tricine-EDTA buffer制備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物,用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應,直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。

中文名

RACE

外文名

rapid-amplification of cDNA ends

1

通過PCR進行

2

cDNA末端快速克隆的技術

優點

與篩庫法相比較:

1)此方法是通過PCR技術實現的,無須建立cDNA文庫,可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。

2)節約了實驗所花費的經費和時間。

3)只要引物設計正確,在初級產物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。[1]

實驗室現有的RACE試劑盒的簡介

?RACE是一種從一個相同的cDNA模板進行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法會產生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。

?使用此方法的要求是必須知道至少23-28個核苷酸序列信息,以此來設計5’末端和3‘末端RACE反應的基因特異性引物(GSPs)。

引物的設計:

基因特異性引物(GSPs)應該是:

?23-28nt

?50-70%GC

?Tm值≥65度,Tm值≥70度可以獲得好的結果

需要實驗者根據已有的基因序列設計5‘和3‘RACE反應的基因特異性引物(GSP1和GSP2).由于兩個引物的存在,PCR的產物是特異性的。

反應中涉及到的一些事項

?cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA,背景會很高。

?RACE PCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。

?在進行5‘和3’RACE PCR的時候應該使用熱啟動。

?表4中給出了所有引物的相互關系。重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外,重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。并不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。

?引物GSP中的GC含量要在50-70%之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列,否則會產生回折和形成分子內氫鍵。另外,避免使用與AP1互補的引物,尤其是在3‘末端。

如果要用重疊片段來檢測設計的引物,GSp1和GSp2之間至少是100-200堿基。只有這樣才可以用擴增的產物來鑒定設計的引物是否正確。

?降落PCR可以明顯的增加RACE PCR產物的特異性。在最開始的循環中,退火溫度高于AP1引物的Tm值,可以增加對特異性條帶的擴增。隨后的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度,可以進行隨后的PCR循環。

?驗證基因特異性引物的對照:

單個引物的陰性對照:只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物,應該改變循環的參數,或重新設計原始引物。

利用兩個GSPS進行陽性對照:(只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以采用此步。)為了確定RNA樣品中目的基因確實表達,利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產生陽性對照??梢援a生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段,應該重復cDNA的合成,或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。

?制備和抽提polyA+RNA

不要使用DEPC處理過的水。

純化完mRNA之后,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5-12kb的拖帶,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小

實驗步驟

①cDNA第一條鏈的合成:

?我們建議進行cDNA合成的對照反應,這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之后,在水浴中42度保溫一個小時。

注意:在水浴或酒精浴中保溫會減少反應體積,從而降低第一鏈的合成效率。

將管放于冰上,以終止第一鏈的合成反應。

直接進行第二鏈的合成。

②cDNA第二鏈的合成:

第二鏈合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照,試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。

?建議進行陽性對照,cDNA的質量取決于制備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5-3kb之間。

?通過電泳檢測cDNA的產量,與對照進行對比,這樣可以有利于在以后的步驟中對cDNA進行稀釋。

接頭的連接及連接產物的稀釋

?按照程序進行連接反應。

?如果沒有對比樣品和對照的產量,利用Tricine-EDTA buffer制備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物,用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應,直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。

RACE-PCR擴增

·進行5’和3’的RACE-PCR擴增。

·利用以下的程序進行降落PCR反應:

94度30秒

5個循環:94度5秒

72度4分鐘

5個循環:94度5秒

70度4分鐘

20-25個循環:94度5秒

68度4分鐘

注意:

我們建議使用降落PCR反應,這就要求GSP的Tm值≥70度。

當循環結束時,利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl,使用適當的分子量marker。

·可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶,在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決于擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2-5kb的時候,經常使用4min,0.2-2kb的時候將延伸時間減到2-3min,對于5-10kb的條帶,延伸時間增加到10min。

③RACE產物的驗證:

{應該對RACE的片段進行驗證,以此來確定是否已經擴增了理想的產物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員,驗證是非常有用的。

有3種驗證RACE產物的方法:

(1)比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。

(2)Southern blot

(3)克隆并測序

{我們建議最好測得RACE產物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。

比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。

{對于5‘末端的RACE產物,比較由AP1和GSP1擴增出來的產物和由AP1和NGSP1擴增出來的產物。

{對于3‘末端的RACE產物,比較由AP1和GSP2擴增出來的產物和由AP1和NGSP2擴增出來的產物。這對于鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產物是非常有用的。

{如果條帶是正確的,在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些?;綪CR和嵌套PCR產物的遷移率的不同取決于cDNA結構中GSP1和嵌套引物的位置。

④RACE產物的克隆和測序:

{可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產物,此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物;對于長的片段,可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。

{電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。

{將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點,將產物克隆到常規載體中

對于5‘端的RACE產物,我們建議挑取至少8-10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。(反轉錄并不總是進行到mRNA模板的5’末端,尤其是長模板。另外,T4 DNA聚合酶會移走5‘末端的0-20個堿基。)

{一旦鑒定了含有插入片斷的克隆,應該獲得多的序列信息。理想的是,可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區。

全長cDNA的獲得

{通過部分或全部測序鑒定了RACE產物后,可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。

通過PCR的方法。

通過克隆的方法。

通過PCR的方法獲得全長cDNA:

?擴增長的cDNA需要較長的延伸時間,但是如果延伸的時間過長,可以產生拖帶,所以要慎重的設計引物。

?根據從5‘和3‘RACE產物獲得序列信息設計5’和3‘GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3’或者5‘的末端,應該是23-28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點,這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。

通過PCR的方法獲得全長cDNA:

?進行如下的熱循環:

94度30秒

25個循環94度5秒

72度2-15分鐘

?延伸的時間應該等于預期的cDNA長度加上2分鐘。例如:預期得到6kb的條帶,用6+2=8分鐘的延伸時間。

?注意:如果沒有條帶或者條帶弱,增加5個循環;或者優化PCR的條件。

通過PCR的方法獲得全長cDNA:

?在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下,可以見到一條單一帶,如果這樣,利用膠來純化全長的cDNA。

?制備1.2%的TAE buffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer,TBE的膠很難制備全長的cDNA。

?將剩下的45μl反應物點樣,選用適當的marker。

?利用長波紫外觀察cDNA(≧300nm)切下全長的cDNA。注意:應該盡量減少紫外對cDNA的照射。

通過PCR的方法獲得全長cDNA:

?利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物;對于長的片段,可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。

?將全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。

通過克隆產生全長的cDNA:

z如果你已經獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE產物,同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話,通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。

z利用酶切獲得的3‘和5’擴增產物,并且利用T4DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。

z在哺乳動物基因組中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大約106bp才出現一次,因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。

Appendix:cDNA接頭和引物z接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行:z接頭的5‘端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點只有通過GSP的擴增之后才能夠產生。z這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外,它們允許從一個復雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的產物都有相同的末端結構,因為使用了單一的一套GSPs。

審計程序

RACE (企業實體與環境調查)

這是在實施審計程序時必要的一個程序。